Laporan Mikrobiologi Pangan dan Keamanan Pangan

STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA1) (STERILIZATION AND MEDIA PREPARATION) Husnul Hatimah2), Ayu Hafidzah3) ABSTRAK Sterilisasi adalah proses membunuh dan memusnahkan semua mikroorganisme termasuk spora bakteri pada alat atau bahan yang telah terkontaminasi. Sterilisasi dalam laboratorium terdiri dari sterilisasi fisik, kimiawi, dan mekanik. Media merupakan suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat untuk menumbuhkan mikroorganisme, isolasi, memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi dan perhitungan jumlah mikroorganisme. Tujuan praktikum ini dilakukan agar dapat memahami prinsip dan metode sterilisasi, jenis dan pembuatan media pertumuhan mikroba. Alat dan bahan yang digunakan antara lain erlenmeyer, pipet volume, bulb, microwave, batang pengaduk, timbangan analitik, autoklaf, Potato Dextrose Agar (PDA), Plate Count Agar (PCA), Nutrient Agar (NA), de Man Ragosa Sharp (MRS), kapas, aluminium foil, akuades. Prosedur kerja praktikum ini adalah media sintetik ditimbang masing-masing dalam takaran 1/3 liter, ditambahkan akuades sebanyak 333,33 ml, dihomogenkan menggunakan microwave, dan disterilkan menggunakan autoclave. Sampel yang digunakan adalah Potato Dextrose Agar (PDA). Hasil praktikum adalah sebelum dihomogenkan serbuk PDA berwarna kuning dan halus, serta setelah dihomogenkan berwarna keemasan dan tampak gelap. Media PDA berfungsi untuk menumbuhkan kapang dan jamur. Medium PDA terdiri dari kentang yang berfungsi sebagai sumber energi, nitrogen organik, karbon dan vitamin, dekstrosa sebagai sumber karbon, agar sebagai bahan pemadat medium dan akuades sebagai pelarut untuk menghomogenkan medium dan sumber O2. Kata Kunci : Sterilisasi, Media Sintetik, PDA ABSTRACT Sterilization is the process of killing and destroying all microorganisms including bacterial spores in contaminated tools or materials. Sterilization in the laboratory consists of physical, chemical, and mechanical sterilization. The medium is a material consisting of a mixture of substances to grow microorganisms, isolate, multiply quantities, test the physiological properties and calculate the number of microorganisms. The purpose of this lab is to understand the principles and methods of sterilization, the type and manufacture of microbial growth media. Tools and materials used are erlenmeyer, volume pipette, bulb, microwave, stirrer, analytical scales, autoclave, Potato Dextrose Agar (PDA), Plate Count Agar (PCA), Nutrient Agar (NA), de Man Ragosa Sharp (MRS ), cotton, aluminum foil, aquades. The procedure for this lab work is synthetic media weighed in 1/3 liter each, added 333.33 ml of distilled water, homogenized using microwave, and sterilized using autoclave. The sample used is Potato Dextrose Agar (PDA). The result of the experiments is before homogenized yellow powder powder is yellow and smooth, and after homogenized golden and looks dark. PDA media serves to grow mold and mold. The medium of PDA consists of potatoes that serve as a source of energy, organic nitrogen, carbon and vitamins, dextrose as a carbon source, in order to compact the medium and distillate as a solvent to homogenize the medium and source of O2. Keywords: Sterilization, Syntetic Medium, PDA I. PENDAHULUAN Sterilisasi adalah proses membebaskan suatu bahan atau benda dari semua aktivitas kehidupan mikroorganisme. Tujuan sterilisasi adalah untuk memusnahkan semua bentuk bakteri patogen termasuk spora yang terdapat pada peralatan laboratorium. Pada proses sterilisasi diperlukan metode yang sesuai dengan sifat bahan yang akan disterilisasikan. Terdapat tiga metode sterilisasi, yaitu sterilisasi mekanik, fisik, dan kimiawi. Adapun proses untuk memperoleh mikroorganisme yang diinginkan, diperlukan medium tumbuh mikroorganisme sesuai dengan kebutuhan nutrisi jenis-jenis mikroorganisme dalam mempertahankan kelangsungan hidupnya. Sehingga perlunya penambahan nutrisi pada media baik bahan organik maupun anorganik. Mikroba patogen terdapat pada bahan pangan atau media tumbuh sehingga perlunya untuk memusnahkan mikroba tersebut dengan proses sterilisasi. Sterilisasi terdiri atas tiga bentuk, yaitu sterilisasi mekanik, fisik, dan kimiawi yang perlu untuk diketahui masing-masing prinsip kerja. Sedangkan media pertumbuhan mikroba yang terdiri atas media sintetis dan semi-sintetis. Beberapa jenis media sintetis yang umumnya digunakan, yaitu Potato Dextrose Agar (PDA), Plate Count Agar (PCA), Nutrient Agar (NA), Yeast Extract Agar (YEA), deMan Ragosa and Sharpe Agar (MRS). Sedangkan media sintetis yang umumnya digunakan, yaitu Tauge Extract Agar (TEA) dan Potato Dextrose Agar (PDA). Oleh karena itu, praktikum ini dilakukan agar dapat memahami prinsip dan metode sterilisasi, jenis-jenis dan pembuatan media yang tidak hanya sekedar teoritis melainkan mampu memahami secara praktis, serta menerapkan dengan prinsip aseptis dalam proses sterilisasi. II. METODOLOGI PRAKTIKUM II.1 Waktu dan Tempat Praktikum ini dilakukan pada Selasa, 12 September 2017 di Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Pangan, Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan, Departemen Teknologi Pertanian, Fakultas Pertanian, Universitas Hasanuddin, Makassar. II.2 Alat dan Bahan Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah erlenmeyer, pipet volume, bulb, microwave, batang pengaduk, timbangan analitik, autoklaf. Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah Potato Dextrose Agar (PDA), Plate Count Agar (PCA), Nutrient Agar (NA), de Man Ragosa Sharp (MRS), kapas, aluminium foil, akuades. II.3 Prosedur Praktikum II.3.1 Sterilisasi Sterilisasi secara fisik dilakukan dengan mencuci alat terlebih dahulu, kemudian ditutup dengan menggunakan kertas dan sterilisasi dengan autoklaf. Sedangkan untuk sterilisasi secara kimia yautu dengan menyemprotkan alat menggunakan alkohol. II.3.2 Pembuatan Media PCA Sebanyak 7,5 gr media PCA (Plate Count Agar) di timbang, kemudian media dimasukkan kedalam erlenmeyer dan dilarutkan dalam aquades 333 ml lalu dihomogenkan menggunakan microwave hingga tidak terlihat lagi endapan(jernih). Setelah itu, larutan PCA disterilisasi dengan menggunakan autoclav pada suhu 121oC dengan tekanan 1 atm selama 15 menit. II.3.3 Pembuatan Media PDA Sebanyak 13 gr media PDA (Potato Dextrose Agar) di timbang, kemudian media dimasukkan kedalam erlenmeyer dan dilarutkan dalam aquades 333 ml lalu dihomogenkan menggunakan microwave hingga tidak terlihat lagi endapan (jernih). Setelah itu, larutan PCA disterilisasi dengan menggunakan autoclav pada suhu 121oC dengan tekanan 1 atm selama 15 menit. II.3.4 Pembuatan Media NA Sebanyak 6,67 gr media NA (Nutrient Agar) di timbang, kemudian media dimasukkan kedalam erlenmeyer dan dilarutkan dalam aquades 333 ml lalu dihomogenkan menggunakan microwave hingga tidak terlihat lagi endapan (jernih). Setelah itu, larutan PCA disterilisasi dengan menggunakan autoclav pada suhu 121oC dengan tekanan 1 atm selama 15 menit. II.3.5 Pembuatan Media MRS Sebanyak 22,7 gr media MRS di timbang, kemudian media dimasukkan kedalam erlenmeyer dan dilarutkan dalam aquades 333 ml lalu dihomogenkan menggunakan microwave hingga tidak terlihat lagi endapan (jernih). Setelah itu, larutan PCA disterilisasi dengan menggunakan autoclav pada suhu 121oC dengan tekanan 1 atm selama 15 menit. III. HASIL DAN PEMBAHASAN III.1 Hasil Hasil yang di peroleh dari praktikum ini adalah sebagai berikut: Tabel 01. Hasil Pengamatan Pembuatan Media Jenis Media Komposisi Warna Merek : BD (Becton, Dickinson and Company) Nama : Potato Dextrose Agar (PDA)  Ekstrak kentang 250 ml  Dextrose 2,5 gr/L  Agar 3,75 gr/L  200 ml akuades  Takaran : 39 gr/L Merek : Merck Nama : Nutrient Agar (NA)  Ekstrak daging 250 ml  Pepton 1,25 gr/L  Agar 3,75 gr/L  200 ml akuades  Takaran : 23 gr/L Merek : Merck Nama : Plate Count Agar (PCA)  0,5% pepton  0,25% ekstrak ragi  0,1% glukosa  1,5% agar  200 ml akuades  Takaran 22,51 gr/L Merek: Merck Nama: de Man Ragosa Sharpe (MRS) - 22,7 gram MRS - 3,33 gr pepton - 1,6 gr ekstrak yeast - 333 ml akuades Setelah dihomogenkan berwarna kemerahan Sumber: Data Primer Praktikum Aplikasi Mikrobiologi dan Keamanan Pangan, 2017. III.2 Pembahasan Sterilisasi adalah proses membunuh dan memusnahkan semua mikroorganisme termasuk spora bakteri pada alat-alat atau bahan-bahan yang telah terkontaminasi. Sedangkan steril adalah keadaan yang tidak adanya mikroorganisme atau bentuk kehidupan dari suatu alat dan bahan. Bertujuan untuk memusnahkan semua bentuk bakteri patogen termasuk spora yang terdapat pada peralatan laboratorium. Macam-macam sterilisasi dalam laboratorium terdiri dari sterilisasi fisik, kimiawi, dan mekanik. Berbagai metode yang dapat dilakukan untuk sterilisasi agar dapat terhindar dari kontaminasi mikroorganisme lain yang tak diinginkan. Adapun macam-macam sterilisasi yang dilakukan pada praktikum ini adalah sterilisasi fisik dan kimiawi. Sterilisasi fisik dilakukan dengan menggunakan uap air panas dan bertekanan tinggi, yaitu penggunaan autoklaf. Adapun alat-alat yang disterilisasikan dengan menggunakan autoklaf, yaitu tabung reaksi, cawan petri, erlenmeyer dan pipet volume. Pada praktikum ini juga dilakukan sterilisasi fisik dengan menggunakan prinsip pemijaran (dengan api langsung), yaitu membakar atau melewatkan alat pada api secara langsung dengan menggunakan bunsen. Adapun alat-alat yang disterilisasikan menggunakan pemijaran, yaitu ose tusuk dan ose bulat. Sterilisasi secara kimiawi menggunakan senyawa desinfektan. Desinfektan adalah suatu bahan kimia yang dapat membunuh sel-sel vegetatif dan jasad renik yang bersifat merusak jaringan, prosesnya disebut desinfeksi. Alat-alat yang disterilisasikan dengan menggunakan senyawa desinfektan yaitu gelas kimia, tabung reaksi, cawan petri, erlenmeyer dan pipet volume. Adapun desinfektan yang digunakan adalah alkohol. Hal ini sesuai dengan pernyataan Suriawiria (1995), bahwa proses sterilisasi terdiri dari tiga metode, yaitu sterilisasi fisik (pemijaran dan udara panas), mekanik (penyaringan), dan kimiawi (etilena oksida, asam perasetat, formaldehida dan glutaraldehida alkalin). Keadaan steril berarti pada alat dan bahan kimia tidak diharapkannya kehadiran mikroba yang akan mengganggu dan merusak media ataupun proses yang sedang dilakukan. Media merupakan suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat untuk menumbuhkan mikroorganisme, isolasi, memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi dan perhitungan jumlah mikroorganisme. Media biakan ini terdiri dari garam organik, sumber energi (karbon) vitamin, dan zat pengatur lainnya. Pembiakan mikroorganisme dalam laboratorium memerlukan media yang berisi zat hara serta lingkungan pertumbuhan yang sesuai dengan mikroorganisme, yaitu pH dan suhu optimum, Aw optimum, nutirisi yang cukup. Hal ini sesuai dengan pernyataan Mirsadiq (2013), bahwa proses pembuatan media hasrus disterilisasikan dan menerapkan metode aseptis untuk menghindari kontaminasi pada media. Media yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunannya dengan kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme yang bersangkutan. Media berdasarkan bentuk terbagi menjadi tiga bagian, yaitu media cair, media semi padat, dan media padat. Perbedaaan utama dari ketiga media adalah ada tidaknya bahan pemadat. Media cair tidak menggunakan bahan pemadat, media semi padat dan media padat menggunakan bahan pemadat. Bahan pemadat yang paling umum digunakan adalah agar-agar. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi pada media berupa molekul-molekul kecil yang menyusun komponen selnya sehingga dapat digunakan untuk mengisolasi mikroorganisme dan pembuatan kultur murni. Hal ini disesuaikan pernyataan Hadietomo (1993), bahwa medium digunakan untuk melihat gerakan dari suatu gerakan mikroorganisme yang bersifat motil atau non motil, medium ini ditambahkan bahan pemadat 50%. Media yang digunakan dalam praktikum ini adalah media sintesis dan semi-sintesis. Adapun media sintesis terdiri dari Nutrient Agar (NA), Potato Dextrose Agar (PDA), dan Plate Count Agar (PCA) yang berbentuk serbuk padatan. Sedangkan media semi-sintesis terdiri dari Potato Dextrose Agar (PDA) dan Tauge Extract Agar (TEA) dalam bentuk ekstrak. Medium Nutrient Agar (NA) berfungsi untuk menumbuhkan mikroba atau bakteri pada permukaan sehingga mudah diisolasi dan diidentifikasi. NA berdasarkan konsistensinya merupakan medium yang berbentuk padat (solid medium) karena dipadatkan menggunakan agar. Berdasarkan susunan kimianya, medium ini merupakan medium sintetik karena disusun dari bahan-bahan kimia dan organik yang terbuat dari ekstrak daging sebagai sumber karbon organik, vitamin, dan garam mineral dalam pertumbuhan mikroba dan pepton sebagai sumber utama nitrogen dan protein bagi mikroba. Mekanisme kerja mikroba pada medium NA adalah Penisilin diproduksi oleh galur Penicillium notatum atau Penicillium chrysogenum yang diinokulasikan pada medium dengan nutrien yang sesuai. Fermentasi pada fase inisiasi melibatkan pertumbuhan dari jamur. Ketika pertumbuhan pada fase stationer terjadilah produksi penisilin. Laju produksi antibiotik merupakan hasil dari sintesis selama proses fermentasi. Hal ini sesuai dengan pernyataan Wahab (2010), bahwa medium NA umumnya ditambahkan bahan-bahan yang bertujuan menstimulasi pertumbuhan mikroba secara umum untuk menstimulasi pertumbuhan bakteri dan mikroba lainnya. Sesuai pernyataan Farooq dkk (2012) bahwa Penggunaan molase dan air lindi dapat menjadi alternative digunakan sebagai medium untuk pertumbuhan Penicillium chrysogenum. Air lindi dapat digunakan sebagai sumber nitrogen dan dan molase dapat digunakan sebagai sumber karbon karena mengandung konsentrasi karbohidrat sebesar 45-60% Medium Potato Dextrose Agar (PDA) berfungsi untuk menumbuhkan kapang dan jamur. PDA yang digunakan dalam praktikum ini termasuk medium sintetik karena penggunaannya secara instant (tanpa proses ekstraksi). Potato dextrose agar termasuk medium padat karena dalam pembuatannya menggunakan agar sebagai bahan pemadat. Medium PDA terdiri dari kentang yang berfungsi sebagai sumber energi, nitrogen organik, karbon dan vitamin, dekstrosa sebagai sumber karbon, agar sebagai bahan pemadat medium dan akuades sebagai pelarut untuk menghomogenkan medium dan sumber O2. Mekanisme kerja mikroba jika diinokulasikan di dalam medium PDA, bakteri anaerob akan tumbuh mengelompok pada dasar medium, bakteri yang anaerob fakultatif akan tumbuh tersebar di seluruh medium, bakteri mikroaerofil akan tumbuh mengelompok sedikit di bawah permukaan medium, sedangkan bakteri aerob akan tumbuh pada permukaan medium. Hal ini sesuai dengan pernyataan Wahab (2010) bahwa medium PDA ini termasuk medium umum karena dapat digunakan untuk menumbuhkan satu atau lebih kelompok jamur, juga digunakan untuk isolasi bakteri, hasilnya dinyatakan dalam jumlah koloni yang diperoleh. Plate Count Agar (PCA) sebagai media untuk menghitung jumlah total dari berbagai jenis bakteri. Medium PCA mengandung nutrisi yang disediakan oleh tripton, vitamin dari ekstrak ragi, dan glukosa yang digunakan sebagai sumber energi bagi mikroorganisme sehingga mendukung pertumbuhan dari bakteri. Plate Count Agar (PCA) bukan merupakan media selektif karena media ini tidak hanya ditumbuhi oleh satu jenis mikroorganisme. Mekanisme kerja mir=kroba pada media PCA adalah Koliform sebagai suatu kelompok dicirikan sebagai bakteri berbentuk batang, gram negatif, tidak membentuk spora, aerobik dan anaerobik fakultatif yang memfermentasi laktosa dengan menghasilkan asam dan gas dalam waktu 48 jam pada suhu 35oC. Adanya bakteri koliform di dalam makanan/minuman menunjukkan kemungkinan adanya mikroba yang bersifat enteropatogenik. Hal ini sesuai dengan pernyataan Hafsah (2009), bahwa PCA berdasarkan fungsinya termasuk medium perhitungan jumlah mikroba dalam suatu bahan. De Man Ragosa Sharpe (MRS) adalah medium pertumbuhan yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri Lactobacillus. Media MRS mengandung polisorbat, asetat, magnesium, dan mangan yang diketahui sebagai faktor penumbuh Lactobacillus sebagai substrat yang kayak akan nutrisi dasar. Bakteri lain yang dapat tumbuh ialah Pediococcus dan Leuconostoc. Mekanisme kerja mikroba pada media MRS yakni bakteri asam laktat merupakan kelompok bakteri yang paling banyak menghasilkan bakteriosin. bakteriosin dari bakteri Gram positif aktif melawan terhadap jenis bakteri Gram positif lain, walaupun pada beberapa jenis (seperti nisin) juga memiliki aktivitas terhadap bakteri Gram negatif ketika membran luarnya telah terpermeabilitas. Hal ini sesuai dengan pernyataan De Man et al (1960) bahwa media MRS merupakan media tumbuh Lactobacillus bahkan beberapa bakteri yang tidak dapat hidup pada media lainnya. Beberapa hal penting harus diperhatikan dalam sterilisasi di laboratorium agar tidak terjadinya kegagalan kerja. Seperti yang diketahui bahwa sterilisasi merupakan proses untuk membebaskan alat dan bahan dari segala macam bentuk kehidupan terutama mikroba. Maka dari itu, proses sterilisasi harus dilakukan dengan berhati-hati, memperhatikan teknik aseptis, dan sesuai dengan prosedur kerja. Hal ini sesuai dengan pernyataan Suhardi (2008), bahwa sistem cara kerja yang berhati-hati dan menjaga sterilitas ketika menangani pengkulturan mikroorganisme akan mencegah terjadinya kontaminasi mikroorganisme yang diinginkan. IV. PENUTUP IV.1 Kesimpulan Kesimpulan dari praktikum ini adalah prinsip sterilisasi adalah penghancuran dan pemusnahan terhadap semua jenis mikroorganisme dengan berbagai metode berdasarkan sifat alat dan bahan yang akan disterilisasikan. Terdapat tiga metode sterilisasi, yaitu sterilisasi fisik, mekanik, dan kimiawi. Adapun jenis-jenis media tanam mikroba diklasifikasikan berdasarkan komposisi, yaitu media alami, sintesis, dan semi-sintesis. Media sintesis terdiri dari Nutrient Agar (NA), Potato Dextrose Agar (PDA), Plate Count Agar (PCA), dan deMan Ragosa and Shape Agar (MRS). IV.2 Saran Perlunya menguji memperhatikan prinsip kerja dengan baik dalam melakukan sterilisasi fisik, mekanik, maupun kimiawi serta dalam pembuatan media sebab resiko terjadinya kesalahan dan kontaminasi sampel kerja sangatlah besar sehingga dapat diminimalisir dengan meningkatkan konsep aseptis dalam bekerja. DAFTAR PUSTAKA Anonim, 2013. http:// repository.usu.ac.id/pdf. Sumatera Utara: Universitas Sumatera Utara. De Man, JC; Rogosa, M; Sharpe, ME. 1960. A Medium for the Cultivation of Lactobacilli. The British Library. Farooq, U., Anjum, F.M., Zahoor, T., Rahman, S.U., Randhawa, M.A., Ahmed, A. dan Akram, K. 2012. Optimization of Lactic Acid Production from Cheap Raw Material: Sugarcane Molasses. Pakistan Journal of Botany 44(1):333-338. Hadietomo, R. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta: Gramedia. Hafsah. 2009. Mikrobiologi Umum. Makassar: Universitas Islam Negeri Alauddin. Mirsadiq, L. 2013. Mikrobiologi Pertanian. Surakarta: Universitas Sebelas Maret. Suhardi, dkk. 2008. Biosafety: Pedoman Keselamatan Kerja di Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Sakit. PT. Multazam Mitra Prima. Suriawiria, U. 1995. Pengantar Mikrobiologi Umum. Jakarta: Angkasa. Wahab, A. 2010. Mikrobiologi Umum. Makassar: Universitas Hasanuddin. Yanti. 2013. Penuntun Mikrobiologi Laut. Bandung: Universitas Padjajaran. LAMPIRAN Lampiran 01. Diagram Alir Pembuatan Media Sintetis